Manuali del Centro Sanitario Studentesco

Scopo e ambito:

Il test di Kirby-Bauer, noto come metodo di diffusione su disco, è il test di suscettibilità antibiotica più usato per determinare quale scelta di antibiotici dovrebbe essere usata quando si tratta un’infezione. Questo metodo si basa sull’inibizione della crescita batterica misurata in condizioni standard. Per questo test, un terreno di coltura, in particolare l’agar Mueller-Hinton, viene uniformemente e asetticamente inoculato con l’organismo di prova e poi dei dischi di carta da filtro, che sono impregnati con una concentrazione specifica di un particolare antibiotico, vengono posti sul terreno. L’organismo crescerà sulla piastra di agar mentre l’antibiotico “lavora” per inibire la crescita. Se l’organismo è suscettibile ad un antibiotico specifico, non ci sarà crescita intorno al disco contenente l’antibiotico. Così, una “zona di inibizione” può essere osservata e misurata per determinare la suscettibilità a un antibiotico per quel particolare organismo. La misurazione viene confrontata con i criteri stabiliti dal Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). In base ai criteri, l’organismo può essere classificato come Resistente (R), Intermedio (I) o Suscettibile (S).

Principio del metodo:

Il mezzo usato in questo test deve essere l’agar Mueller-Hinton (15x150mm) perché è un agar che è accuratamente testato per la sua composizione e il suo livello di pH. Inoltre, l’utilizzo di questo agar assicura che le zone di inibizione possano essere riprodotte dallo stesso organismo, e questo agar non inibisce i sulfamidici. L’agar stesso deve anche essere profondo solo 4 mm. Questo assicura ulteriormente la standardizzazione e la riproducibilità.

Anche la dimensione dell’organismo inoculato deve essere standardizzata (usando lo standard MCFarland 0.5 Latex con la Wickersham Card. Le ragioni sono che se la dimensione dell’inoculo è troppo piccola, la zona di inibizione sarà più grande di quello che dovrebbe essere (“gli antibiotici avranno un netto vantaggio”) e se l’inoculo è troppo grande, la zona di inibizione sarà più piccola.

Requisiti del campione:

Solo colonie ben isolate da piastra agar BAP.

Controllo di qualità:

Eseguire il controllo di qualità settimanale per i dischi antimicrobici allestendo la coltura stock di E. coli (ATCC 25922), S. aureus (ATCC 25923) ed E. coli (ATCC 35216) sensibilità Kirby Bauer utilizzando la procedura specificata per “Preparazione della sospensione batterica”. Le dimensioni delle zone dovrebbero essere le seguenti:

E. coli (ATCC 35216)

Augmentin (AmC30) 17-22 mm

Reagenti e materiali di consumo:

Piastre di agar Mueller Hinton 50×150 mm

Dischi di suscettibilità Hardy Diagnostics (vari antimicrobici come in QC sopra)

Incubatore a 37 C

Tamponi sterili in poliestere o cotone

Tubi saline Hardy Diagnostic

McFarland Latex 0. 5 Standard e Wickerham Card.5 Standard e Wickerham Card

Calibri, righello o template per misurare i diametri delle zone inibitorie.

Procedura:

  • Preparazione della sospensione batterica
  1. Rimuovere una provetta Hardy Diagnostic Saline 0.85%, 1.8mL dalla scatola, etichettarla con il nome del paziente e metterla in un portaprovette.
  2. Utilizzando un’ansa da 1ul, prelevare diverse colonie isolate dalla superficie dell’agar.
  3. Immettere l’ansa in una provetta salina etichettata. Vortex.
  4. Utilizzando una Wickerham Card e uno standard McFarland Latex 0.5 vortexato, confrontare la torbidità della provetta salina inoculata con lo standard. Se la torbidità è comparabile, procedere con l’inoculazione della piastra Mueller Hinton. In caso contrario, regolare la torbidità aggiungendo più colonie isolate nello stesso modo se la torbidità è inferiore allo standard o più soluzione salina se la torbidità è maggiore. Una volta che la torbidità è paragonabile allo standard, procedere con l’inoculazione della piastra Mueller Hinton etichettata.
  5. La sospensione batterica dovrebbe essere usata entro 6 ore dalla preparazione. Se non viene utilizzata subito dopo la preparazione, agitare vigorosamente per risospendere i batteri appena prima dell’uso.
  • B. Inoculazione di Mueller Hinton Agar

Lasciare le piastre a temperatura ambiente prima dell’uso.

  1. Impiegare un tampone di cotone sterile nella sospensione batterica. Per rimuovere il liquido in eccesso, ruotare il tampone diverse volte con una pressione decisa sulla parete interna della provetta sopra il livello del liquido.
  2. Utilizzando il tampone, strisciare la piastra di agar Mueller-Hinton per formare un prato batterico.
  3. Per ottenere una crescita uniforme, strisciare la piastra con il tampone in una direzione, ruotare la piastra di 90° e strisciare nuovamente la piastra in quella direzione.
  4. Ripetere questa rotazione 3 volte.Lasciare asciugare la piastra per circa 5 minuti.
  5. Utilizzare un Antibiotic Disc Dispenser per dispensare dischi contenenti antibiotici specifici sulla piastra.
  6. Utilizzando bastoncini o anelli sterili, premere delicatamente ogni disco sull’agar per assicurarsi che il disco sia attaccato all’agar.
  7. Le piastre devono essere incubate durante la notte ad una temperatura di incubazione di 37°C.

C. Lettura e interpretazione delle dimensioni delle zone

  1. Dopo l’incubazione notturna misurare le dimensioni delle zone (area di assenza di crescita intorno al disco) in millimetri usando un righello o un modello.
  2. Inserire le dimensioni delle zone nel registro di sensibilità Kirby Bauer insieme alle informazioni sui pazienti.
  3. Interpretare i risultati come resistenti, intermedi o sensibili per ogni antimicrobico secondo gli intervalli elencati nel registro per i bastoncini gram negativi enterici.
  4. Inserire i risultati (R, I o S) nel LIS.
  5. Per le specie di Staph che sono resistenti alla Cefoxitina (Oxacillina), la Penicillina e la Cefazolina saranno riportate come “non efficaci per MRSA”.

Limitazioni

Questo sistema è impostato solo per i bastoncini gram negativi enterici o i cocchi gram positivi dello Staph aureus. Pertanto assicurarsi che l’organismo gram negativo sia fermentante il lattosio e negativo all’ossidasi prima di impostare il sistema.

Non enterici, streptococchi/enterococchi, bastoncini gram positivi e cocchi gram negativi devono essere inviati a Quest se sono necessarie sensibilità.

BD BBL Prompt Inoculation System Pkg insert #5308-10 Rev 06/2010

Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, e M. Turck. 1966. Test di suscettibilità agli antibiotici

con un metodo a disco singolo standardizzato. Am. J. Clin.

Pathol. 45:493 496.